Hải quân Hoàng gia trong những năm 1939–43 được đặt dưới quyền chỉ huy của First Sea Lord Đô đốc Dudley Pound. Do những thay đổi trước đó, Hải quân Hoàng gia Anh tham gia Chiến tranh thế giới thứ hai với tư cách là một lực lượng kì cựu từ thời Đại Chiến. Các tàu chiến của Hoàng Gia lúc này cũng bị giới hạn bởi việc Anh Quốc tuân thủ chặt chẽ các hạn chế của hiệp ước và các thiết kế hạn chế được tạo ra bởi các hiệp ước giới hạn khí tài. Điều này khiến cho chiến hạm của RN bị lép vế khá nhiều so với các đối thủ. Mặc dù nhỏ hơn và tương đối yếu hơn so với thời Đại chiến, Hải quân Hoàng gia vẫn là lực lượng đông quân nhất thế giới cho đến khi bị Mĩ vượt mặt vào năm 1943
Trong giai đoạn đầu của Thế chiến, Hải quân Hoàng gia đã hỗ trợ các cuộc di tản của Anh khỏi Na Uy (dù mất một mẫu hạm và 6 tàu khu trục hạm nhưng 338.000 người đã được sơ tán), từ Dunkirk (nơi 7.000 lính RN đã thiệt mạng) và tại Hy Lạp. Trong các chiến dịch sau đó, Đô đốc Cunningham đã mạo hiểm rất nhiều để rút quân và đã cứu được rất nhiều quân nhân, những người sẽ quay lại chiến đấu trong một ngày không xa. Uy tín của Hải quân đã bị giáng một đòn nặng nề khi tuần dương chiến hạm Hood bị thiết giáp hạm Bismarck đánh chìm vào tháng 5 năm 1941. Mặc dù chiếc Bismarck bị đánh chìm vài ngày sau đó, niềm tự hào của công chúng đối với Hải quân Hoàng gia đã bị tổn hại nghiêm trọng do để mất “Hood Tinh nhuệ (The Mighty Hood)”. RN sau đó đã thực hiện một cuộc bắn phá Oran ở Algeria nhằm vào Hạm đội Địa Trung Hải của Pháp. Trong cuộc tấn công vào cảng Taranto, máy bay ném ngư lôi Fairey Swordfish đã đánh chìm ba thiết giáp hạm Ý trong căn cứ hải quân của họ và tại Cape Matapan ngay sau đó chị em nhà Elizabeth, các thiết giáp hạm từ thời Đại chiến, đã quất cho 3 chị em nhà tuần dương hạm Zara của Ý lên bờ xuống ruộng.
Trong các chiến dịch năm 1943 RN rất quan trọng đối với các hoạt động đổ bộ như các cuộc xâm lược Tây Bắc Phi (Chiến dịch Bó Đuốc), Sicily, Ý và Normandy (Chiến dịch Overlord). Đặc biêt trong Chiến dịch Hải Vương, Hải quân Hoàng Gia đã cung cấp 958 trong số 1213 tàu chiến và 3/4 số tàu đổ bộ được sử dụng. Việc dùng các bến cảng tại Mulberry cho phép các lực lượng xâm lược được tiếp tế đều đặn.
Tuy nhiên, trong suốt cuộc chiến, rõ ràng hàng không mẫu hạm đã bắt đầu nảy nở, và ưu thế hải quân trước đây của Anh về thiết giáp hạm đã trở nên không còn phù hợp. Anh là nước sớm đổi mới thiết kế tàu sân bay, giới thiệu sàn đáp bọc thép để thích hợp cho khí hậu Đại Tây Dương. Hải quân Hoàng gia giờ đây đã bị đồng minh của nó, Hải quân Hoa Kỳ đánh bại. Cuộc xâm lược thành công châu Âu đã làm giảm vai trò của hải quân châu Âu trong việc hộ tống các đoàn tàu vận tải và hỗ trợ hỏa lực cho quân đội gần bờ biển như tại Walcheren trong trận Scheldt.
Tại Châu Á, Hạm đội Phương Đông của Anh đã được rút về Đông Phi vì cuộc xâm lược của Nhật Bản vào Ấn Độ Dương. Bất chấp sự phản đối của người đứng đầu hải quân Hoa Kỳ, Đô đốc Ernest King, Hải quân Hoàng gia đã gửi một lực lượng đặc nhiệm lớn đến Thái Bình Dương (Hạm đội Thái Bình Dương của Anh). Điều này đòi hỏi phải sử dụng các kỹ thuật hoàn toàn khác, đòi hỏi một đoàn tàu hỗ trợ đáng kể, tiếp tế trên biển và chú trọng sức mạnh phòng không cũng như không quân hải quân vì mỗi đe dọa từ máy bay của Nhật. Năm 1945, 84 tàu chiến và tàu hỗ trợ đã được gửi đến Thái Bình Dương. Đây vẫn là hoạt động triển khai nước ngoài lớn nhất của Hải quân Hoàng gia đến nay. Cuộc tấn công lớn nhất của họ là vào các nhà máy lọc dầu ở Sumatra để cắt nguồn cung cấp dầu của Nhật Bản. Tuy nhiên chiến dịch cũng dùng để nghi binh cho việc Mỹ đổ bộ lên Okinawa và thực hiện các cuộc không kích và bắn phá đất liền Nhật Bản.
Vào đầu Đệ nhị Thế chiến, Hải quân Hoàng Gia có 15 thiết giáp hạm và tuần dương chiến hạm với 5 chiếc đang được đóng mới cùng 66 tuần dương hạm với 23 chiếc khác đang được đóng. Ngoài ra còn có 184 khu trục hạm với 52 chiếc nữa đang được xây dựng, 50 tàu khu trục cũ (và các tàu nhỏ khác) đã được Mỹ bán cho Anh để đổi lấy việc Mỹ được quyền sử dụng chung các căn cứ trên lãnh thổ Anh. Có 60 tàu ngầm và 7 mẫu hạm với nhiều hơn đang được đóng. Cuối Thế chiến, Hoàng Gia có 16 thiết giáp hạm, 52 mẫu hạm mặc dù chỉ có 10 mẫu hạm chính quy, 62 tuần dương hạm, 257 tàu khu trục, 131 tàu ngầm và 9.000 tàu khác. Trong chiến tranh, Hải quân Hoàng gia Anh đã mất 278 tàu chiến và hơn 1.000 tàu nhỏ. Khi bắt đầu cuộc chiến, RN có khoảng 200.000 nhân sự (bao gồm cả lực lượng dự bị và lính thủy đánh bộ), con số này đã tăng lên 939.000 người vào cuối cuộc chiến. 51.000 thủy thủ RN và 30.000 người từ các đoàn vận tải đã thiệt mạng. Hải quân Hoàng Gia cũng là lực lượng duy nhất từng đối đầu cùng lúc hải quân của cả 3 nước phe Trục mà vẫn giữ được các vị trí chiến lược và sức lực cũng như từng tham gia vào tất cả các chiến dịch đổ bộ quy mô lớn được tổ chức.
